多重退火循环扩增法

基于多重退火和循环的扩增循环（多重退火循环扩增法）是一种准线性全基因组扩增方法。 与非线性或指数的传统 DNA 扩增方法（在每个循环中，复制的 DNA 可以作为后续循环的模板）不同，多重退火循环扩展法利用特殊的引物，允许扩增子具有互补末端并因此循环，防止 DNA 以指数方式复制。 这导致仅扩增原始基因组 DNA，因此减少了扩增偏差。 多重退火循环扩展法是“用于创建覆盖大部分基因组的重叠鸟枪法扩增子”。 对于下一代测序，多重退火循环扩展法之后是常规 PCR，用于进一步扩增扩增子。

在多重退火循环放大法之前，单个细胞通过各种方法分离，包括激光捕获显微切割、微流体装置、流式细胞术或微移液，然后裂解。 多重退火循环扩展法 单细胞全基因组扩增涉及淬灭、延伸、解链和成环 5 个循环。

• 单细胞分离和裂解 – 从单细胞中分离出的 pg 基因组 DNA 片段（10 至 100 kb）用作模板。
• 熔化 – 在 94°C 下，双链 DNA 分子熔化成单链形式。
• 淬灭——熔解后，立即将反应淬火至 0°C，并向反应中添加多重退火循环扩展法引物。
• 延伸 – Bst DNA 聚合酶（大片段）在 65 °C 下将引物延伸 2 分钟，产生半扩增子。
• 熔解 – 将反应加热回 94°C，以将半扩增子与基因组 DNA 模板分离。
• 淬灭 – 反应在 0°C 下快速淬灭，然后添加相同的聚合酶混合物。 多重退火循环扩展法引物可有效结合半扩增子和基因组DNA模板。
• 延伸 – Bst DNA 聚合酶（大片段）在 65°C 下将引物延伸 2 分钟。 这一步以半扩增子为模板制作全扩增子，以基因组DNA模板为模板制作半扩增子。
• 熔化 – 将反应加热至 94°C 以将扩增子与模板分离。
• 循环 – 对于完整的扩增子，3′ 末端序列现在与 5′ 末端互补。 在 58 °C 时，两端杂交形成环状 DNA。 这可以防止完整的扩增子在随后的多重退火循环扩展法循环中用作模板。
• 重复步骤 6-9 五次 – 5 个线性多重退火循环扩增扩增循环。
• 常规 PCR——多重退火循环扩增法产物通过 PCR 进一步扩增。 通过使用27个常见核苷酸作为引物，只扩增完整的扩增子。

在 PCR 结束时，皮克的遗传物质被放大到微克的 DNA，产生足够的 DNA 进行测序。

多重退火循环扩展法提供了一种从单个细胞中扩增 DNA 的无偏方法。 这种单细胞测序方法有大量应用，其中许多尚未开发。 多重退火循环扩展法可能有助于法医标本的分析、遗传疾病的产前筛查、了解生殖细胞的发育或阐明肿瘤的复杂性。 在其基础上，这项技术允许研究人员观察突变在单个细胞中积累的频率。