相衬显微技术

相衬显微技术 (PCM) 是一种光学显微技术，可将穿过透明标本的光的相移转换为图像的亮度变化。 相移本身是不可见的，但在显示为亮度变化时变得可见。

当光波穿过真空以外的介质时，与介质的相互作用会导致波幅和相位根据介质的特性发生变化。 振幅（亮度）的变化是由光的散射和吸收引起的，这通常与波长有关，并且可能会产生颜色。 摄影设备和人眼只对振幅变化敏感。 因此，如果没有特殊安排，相变是不可见的。 然而，相变通常传达重要信息。

相对显微技术在生物学中尤为重要。它揭示了许多用明视野显微镜看不到的细胞结构，如图所示。早期的显微镜学家通过染色使这些结构可见，但这需要额外的准备和死亡 细胞。相差显微镜使生物学家能够研究活细胞以及它们如何通过细胞分裂增殖。 它是为数不多的不使用荧光来量化细胞结构和成分的方法之一。相差显微镜在 1930 年代初发明后，被证明是显微镜领域的一大进步，其发明者 Frits Zernike 获得了诺贝尔奖 1953年获得物理学博士学位。

在相差显微镜中使相变可见的基本原理是将照明（背景）光与标本散射光（构成前景细节）分开，并以不同方式处理这些光。

通过聚光环的环形照明光（绿色）被聚光镜聚焦在样品上。 一些照明光被样本（黄色）散射。 剩余的光不受样本影响并形成背景光（红色）。 当观察未染色的生物标本时，散射光较弱并且通常相移 -90°（由于标本的典型厚度和生物组织与周围介质之间的折射率差异）相对于背景光。 这导致前景（蓝色矢量）和背景（红色矢量）具有几乎相同的强度，从而导致图像对比度低。

在相差显微镜中，图像对比度通过两种方式增加：通过在包含标本的视野区域中的散射光线和背景光线之间产生相长干涉，以及通过减少到达图像平面的背景光量 . 首先，背景光通过相移环被相移-90°，消除了背景光和散射光之间的相位差。

当光线然后聚焦在图像平面（放置相机或目镜的地方）时，这种相移会导致背景和散射光线从包含样品的视野区域（即前景）产生相长干涉 , 导致这些区域的亮度与不包含样本的区域相比有所增加。 最后，灰色滤镜环将背景调暗 ~70-90%； 该方法最大化照明光产生的散射光量，同时最小化到达图像平面的照明光量。 一些照亮滤光片整个表面的散射光将被环相移和调暗，但程度远小于背景光，背景光仅照亮相移和灰色滤光片环。

以上描述了负相衬。 在其正面形式中，背景光相移了 +90°。

背景光因此将相对于散射光异相 180°。 然后从背景光中减去散射光以形成具有较暗前景和较亮背景的图像。

相差显微镜的成功催生了许多后续的相差成像方法。1952 年，Georges Nomarski 获得了今天称为微分干涉相差 (DIC) 显微镜的专利。它通过创建人工阴影来增强对比度，就好像 物体从侧面被照亮。 但当物体或其容器改变偏振时，DIC 显微镜不适用。 随着细胞生物学中越来越多地使用偏光塑料容器，DIC 显微镜越来越多地被罗伯特霍夫曼于 1975 年发明的霍夫曼调制对比显微镜所取代。

传统的相衬方法在光学上增强对比度，在单个图像中混合亮度和相位信息。