基因敲除

基因敲除（缩写：KO）是一种遗传技术，其中使生物体的一个基因失效（从生物体中敲除）。 然而，KO也可以指被敲除的基因或携带基因敲除的生物体。 基因敲除生物或简单的基因敲除用于研究基因功能，通常是通过研究基因丢失的影响。 研究人员通过基因敲除生物体与正常个体的差异进行推论。

KO 技术本质上与基因敲入相反。 在生物体中同时敲除两个基因被称为双敲除 (DKO)。 类似地，术语三重敲除 (TKO) 和四重敲除 (QKO) 分别用于描述三个或四个被敲除的基因。 然而，需要区分杂合子和纯合子 KO。 在前者中，两个基因拷贝（等位基因）中只有一个被敲除，在后者中两个都被敲除。

敲除是通过多种技术完成的。 最初，确定了自然发生的突变，然后必须通过 DNA 测序或其他方法确定基因丢失或失活。

传统上，同源重组是导致基因敲除的主要方法。 该方法涉及创建包含所需突变的 DNA 构建体。 出于敲除目的，这通常涉及用耐药标记代替所需的敲除基因。 该构建体还将包含与目标序列至少 2kb 的同源性。 可以通过显微注射或电穿孔将构建体递送至干细胞。 然后，该方法依靠细胞自身的修复机制将 DNA 结构重组为现有 DNA。 这导致基因的序列被改变，并且大多数情况下基因将被翻译成无功能的蛋白质，如果它被翻译的话。 然而，这是一个低效的过程，因为同源重组仅占 DNA 整合的 10-2 到 10-3。 通常，构建体上的药物选择标记用于选择发生重组事件的细胞。

这些现在缺乏该基因的干细胞可以在体内使用，例如在小鼠中，方法是将它们插入早期胚胎。 如果由此产生的嵌合小鼠在其种系中包含遗传变化，则可以将其传递给后代。

在大多数基因包含两个等位基因的二倍体生物体中，还可能包含几个以相同角色协作的相关基因，进行额外轮次的转化和选择，直到每个目标基因都被敲除。 可能需要选择性育种来产生纯合基因敲除动物。

目前使用三种方法涉及精确定位 DNA 序列以引入双链断裂。 一旦发生这种情况，细胞的修复机制将尝试修复这种双链断裂，通常是通过非同源末端连接 (NHEJ)，这涉及将两个切割末端直接连接在一起。 这可能做得不完美，因此有时会导致碱基对的插入或缺失，从而导致移码突变。 这些突变可以使它们所在的基因失去功能，从而产生该基因的敲除。 这个过程比同源重组更有效，因此可以更容易地用于创建双等位基因敲除。

锌指核酸酶由可以精确靶向 DNA 序列的 DNA 结合域组成。 每个锌指都可以识别所需 DNA 序列的密码子，因此可以模块化组装以与特定序列结合。 这些结合域与限制性核酸内切酶偶联，可导致 DNA 中的双链断裂 (DSB)。 修复过程可能会引入破坏基因功能的突变。

转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 也包含一个 DNA 结合域和一个可以切割 DNA 的核酸酶。 DNA 结合区由氨基酸重复组成，每个氨基酸重复识别所需目标 DNA 序列的单个碱基对。

如果这种切割针对基因编码区，并且 NHEJ 介导的修复引入了插入和缺失，则通常会导致移码突变，从而破坏基因的功能。

成簇规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 是一种基因组编辑方法，其中包含与 Cas9 蛋白复合的指导 RNA。 指导 RNA 可以通过简单的互补碱基配对来设计以匹配所需的 DNA 序列，这与锌指或 TALEN 所需的耗时的构建体组装相反。 偶联的 Cas9 将导致 DNA 双链断裂。