4Pi显微镜
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4Pi显微镜
4Pi显微镜是一种具有改进的轴向分辨率的激光扫描荧光显微镜。 有了它，轴向分辨率的典型范围 500-700 nm 可以提高到 100-150 nm，这对应于一个几乎球形的焦斑，其体积比标准共聚焦显微镜小 5-7 倍。
工作原理
分辨率的提高是通过使用两个相对的物镜实现的，它们都聚焦在相同的几何位置。 此外，通过两个物镜中的每一个的光程长度差异都经过仔细对齐，以达到最小。 通过这种方法，驻留在两个物镜的共同焦点区域中的分子可以从两侧被相干地照亮，并且反射或发射的光也可以被相干地收集，即发射光在检测器上的相干叠加是可能的。 用于照明和检测的立体角 Ω {displaystyle Omega } 增加并接近其xxx值。 在这种情况下，样品会同时从所有侧面被照射和检测。
4Pi显微镜的工作模式如图所示。 激光由分束器分开，并由反射镜引导至两个相对的物镜。 在两个聚焦光束的共同焦点处发生叠加。 这个位置的激发分子发出荧光，荧光由两个物镜收集，由同一个分束器组合并由二向色镜偏转到检测器上。 两个发射光路的叠加可以再次发生。
在理想情况下，每个物镜都可以从 Ω = 2 π {displaystyle Omega =2pi } 的立体角收集光线。 使用两个物镜，可以从各个方向收集（立体角 Ω = 4 π {displaystyle Omega =4pi } ）。 这种显微镜的名称来源于激发和检测的xxx可能立体角。 实际上，物镜的孔径角只能达到约 140°，对应于 Ω ≈ 1.3 π {displaystyle Omega approx 1.3pi } 。
显微镜可以三种不同的方式操作：在 A 型 4Pi 显微镜中，激发光的相干叠加用于产生更高的分辨率。 发射光要么仅从一侧检测到，要么从两侧检测到非相干叠加。 在 B 型 4Pi 显微镜中，只有发射光会产生干扰。 当在 C 型模式下操作时，激发光和发射光都被允许干涉，从而导致尽可能高的分辨率增加（与共聚焦显微镜相比，沿着光轴约 7 倍）。
在真正的 4Pi 显微镜中，光不能均匀地从所有方向应用或收集，从而导致点扩散函数中出现所谓的旁瓣。 通常（但不总是）双光子激发显微镜在 4Pi 显微镜中与发射针孔结合使用，以将这些旁瓣降低到可容忍的水平。
历史
1971 年，Christoph Cremer 和 Thomas Cremer 提议创建一个完美的全息图，即携带点源在各个方向发射的整个场信息的全息图，即所谓的 4 π {displaystyle 4pi } 全息图。 然而，1978 年的出版物得出了一个不正确的物理结论（即点状光斑），并且完全忽略了轴向分辨率增加是增加立体角另一侧的实际好处。 Stefan Hell 于 1991 年发明了 4Pi 显微镜实用系统的xxx个描述，即具有两个相对的干涉透镜的装置。他在 1994 年通过实验证明了它。
在接下来的几年里，这种显微镜的应用数量不断增加。 例如，样品中 64 个点的平行激发和检测同时结合改进的空间分辨率，导致 2002 年用 4Pi 显微镜成功记录了酵母细胞中线粒体的动态。
显微镜制造商 Leica Microsystems 推出了商业版本 2004 年，后来停产。
到目前为止，4Pi 显微镜的最佳质量是结合受激发射耗尽 (STED) 原理等超分辨率技术实现的。 使用具有适当激发和去激发光束的 4Pi 显微镜，可以创建一个统一的 50 nm 大小的光斑，这对应于与共聚焦显微镜相比，固定细胞中聚焦体积减小了 150-200 倍。 通过将 4Pi 显微镜和具有可切换蛋白质的 RESOLFT 显微镜相结合，现在可以在低光照水平下以低于 40 nm 的各向同性分辨率拍摄活细胞图像。